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尖銳濕疣的基因診斷

    尖銳濕疣是常見的一種傳染性疾病,迄今,HPV難于用傳統的病毒培養及血清學技術檢測,主要實驗診斷技術是核酸雜交。近年來發展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優點,為HPV檢測開辟了新途徑。尖銳濕疣要怎么進行診斷呢?我們看看下面的具體介紹。

  (一)標本的采集及處理

  1.標本的采集和預處理:用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細胞。在作細胞學檢查的同時,將標本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中,用PBS離心(3000g,10min)洗滌2次,沉積細胞重懸于1mlPBS中,取0.5ml細胞懸液抽提DNA。

  2.標本核酸的提取:按1體積細胞懸液加10倍體積的細胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,10mmol/L EDTA,150mmol/L NaCl,0.4%SDS,1.0mg/ml蛋白酶K)37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿(1:1),氯仿/異戊醇(24:1)各抽提2次;加1/10體積3mol/L NaAc(pH 5.2)及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉淀DNA;加1體積乙醇洗滌1次;用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1.0mmol/L EDTA)溶解DNA,37℃溫育30min。

  (二)PCR擴增

  1. 引物設計和合成:HPV基因組可分為早期區(E)和晚期區(L),每區含一系列開放讀碼框架(ORF)。序列分析表明,各型HPV的非編碼區及E1、E6、E7和L1區均有保守序列。Manos等從HPVL1區中選擇保守序列設計合成引物MY11和MY09見表1,該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補序列,也可擴增其它型HPV。

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