灰指甲的診斷常根據患者的病程、癥狀、指(趾)甲的外觀就可以確立，但明確診斷還需要依靠甲的真菌檢查。指(趾)甲出現異常并不一定就是灰指甲，許多皮膚疾病和全身性疾病都可能累及指(趾)甲導致指甲變形、變色、增厚、出現白點、表面隆起或凹陷等改變。牛皮癬、甲濕疹、連續性肢端皮炎、雷諾綜合征等疾病導致指(趾)甲的改變都與灰指甲類似，由于這些疾病都不是感染性疾病，不能查到病原菌，以此可與灰指甲可以鑒別。
患者自己往往很難分辨指甲改變的原因，醫生也不能單憑經驗而下診斷，確診灰指甲最根本的證據就是真菌檢查。在患甲上刮取少量碎屑，直接涂片用顯微鏡觀察或者在真菌培養基上培養，真菌感染者可看到真菌的孢子和菌絲或培養出真菌菌落，而非真菌感染者則不能看到或培養出。
無論顯微鏡檢查還是培養基培養，在采取標本時都應刮取盡可能細的患甲細末，有些醫院由于條件有限不能進行真菌檢查，可將患甲細末寄到大醫院去檢查，一般不會影響檢查結果的正確性。